5. Les objectifs du microscope optique à fond clair
par Jean-Pierre GAVERIAUX

00. Le microscope : l'outil indispensable au mycologue
01. Le principe de fonctionnement du microscope optique à fond clair
02. La partie mécanique du microscope
03. Le dispositif d'éclairage
04  La partie optique : Aberrations chromatiques et géométriques
05. Les objectifs
06. Les condenseurs
07. Les oculaires
08. Principaux accessoires
09. Entretenir son microscope

Les objectifs donnent une image réelle, inversée et agrandie de l’objet. Éléments essentiels dans la constitution des images, les objectifs sont définis par plusieurs caractéristiques, certaines étant gravées sur le fût de l’objectif.

Pièces maîtresses du microscope, les objectifs seront manipulés avec beaucoup de soin.
Bloc optique avec 5 objectifs Fluotar du Leica Ortholux (Didier Lefebvre - SMNF)
 

Plus leur angle de capture est grand, plus ils sont aptes à montrer les petits détails. Les physiciens ont ainsi défini l’ouverture numérique par le formule :

Ouverture numérique = ON = NA (Numerical aperture) = n sin α

n = indice de réfraction du milieu dans lequel travaille l’objectif (1 pour l’air ; 1,515 pour le verre ordinaire ; 1,515 ou 1,518 pour l’huile à immersion).
α = angle formé par l’axe de l’objectif et les rayons extrêmes le traversant et participant à la formation de l’image.
Plus l’objectif grandit l’image, plus son ON augmente. Pour les objectifs 100 à immersion l’ouverture numérique dépasse 1 (1,25 à 1,40 pour les plus performants).

Un anneau de couleur permet d’identifier le grandissement de l’objectif.

Caractéristiques de l’objectif ; certaines d’entre elles sont gravés sur le fût.
Ces indications ne sont pas standardisées mais les termes très proches les uns des autres permettent de trouver rapidement les principales références.

Liste simplifiée des principaux sigles et leur signification :

A ; Achro ; Achromat = objectifs achromatiques
Apo ; Apochromat = objectifs apochromatiques
DIC ; NIC = obj. pour contraste interférentiel (Contraste de Nomarski)
ELWD = obj. pour extra longue distance de travail
Epi = objectifs pour épi-illumination
Fl ; Fluo ; Neofluar ; Fluotar ; Semi-apo = objectifs à la fluorine = obj. semi-apochromatiques
Fluo-plan ; Pl-Fl = objectifs plans semi-apochromatiques ou plans à la fluorine
G.F. = objectifs grand champ
Gly = Immersion dans la glycérine
H = pour utilisation avec une platine chauffante.
HI = Immersion homogène
I ; Iris ; W/Iris = objectif muni d’un diaphragme permettant la modification de l’ouverture numérique (exemple lors de l’utilisation avec condenseur pour fond noir).
Korr ; Corr, W/Corr ; CR = objectif avec bague permettant l’ajustement à l’épaisseur de la lamelle.
LU = Obj. (Nikon) universel pour fond clair, fond noir, contraste de phase et lumière polarisée.
LWD = Obj. pour grande distance de travail (Long-Working-Distance)
M = objectifs pour métallographie (n’utilisant pas de lamelle couvre-objet).
NCG = objectifs pour observation sans lamelle couvre-objet (No-Cover Glass)
Oil ; Oel = obj. nécessitant l’immersion dans l’huile.
P ; Pol = objectifs spéciaux pour lumière polarisée
P ; Pol ; SF = objectif sans contrainte (strain free) utilisé pour avoir une lumière polarisée de haute qualité.
Ph ; Phaco = objectifs pour contraste de phase en association avec un condenseur spécial
Plan ; Pl ; NPl = objectifs planachromatiques
Planapo ; Apoplan = objectifs planapochromatiques
SLWD = obj. pour très longue distance de travail (Super-Long-Working-Distance).
UPLAN = Obj. (Olympus) universel pour fond clair, fond noir, contraste de phase et lumière polarisée.
UV = obj. ayant un traitement particulier des surfaces des verres spéciaux afin de permettre le travail dans l’ultraviolet (λ < 400 nm).
Water ; WI ; Wasser = Immersion dans l’eau.

Les lettres sont noires pour les types standards, rouges pour les objectifs destinés à la lumière polarisée et vertes pour le contraste de phase.
 

C’est la distance entre la position d’insertion de l’objectif et le sommet du tube optique qui reçoit l’oculaire. Pendant de nombreuses années cette longueur a été fixée à 160 mm, ce qui signifie, par exemple, qu’un objectif 10x donne à cette distance une image corrigée des aberrations géométriques et agrandie 10 fois. La norme s’est ensuite établie à 170 mm, 180 mm, 210 mm... (Attention lors de l’achat d’objectifs en occasion ! L’objectif acheté doit correspondre à la longueur de tube du microscope sur lequel il sera monté).

Trajet des rayons lumineux avec un objectif corrigé pour une distance finie
(par exemple 160 mm)

Les microscopes de nouvelle génération sont actuellement proposés avec des systèmes optiques corrigés pour l’infini ; dans le tube optique du microscope il y a un groupe de  lentilles supplémentaires (= lentille de tube). Sur le fût des objectifs corrigés à l’infini on trouve le signe ¥.

Trajet des rayons lumineux avec un objectif corrigé pour une distance infinie
[en réalité 250 mm correspondant la la DMVD distance minimale de vision distincte
 pour un oeil normal (= oeil emmétrope)]

Pour l’utilisateur, ce tube uniforme ‘infini’ offre des avantages ; les objectifs corrigés à l’infini sont interchangeables sur tous les microscopes adaptés à l’infini et il est possible, sans dommage pour l’image finale, d’ajouter divers équipements sur le trajet optique entre l’objectif et l’oculaire.
 

La lamelle induit un excès de sphéricité qui est compensé dans l’objectif. Ceci nécessite une épaisseur constante de la lamelle fixée à 0,17 mm. Certains objectifs possèdent une bague correctrice qui permet l’ajustement à l’épaisseur de la lamelle. Pour les objectifs à immersion qui travaillent dans l’huile, l’épaisseur du couvre-objet est peu important, l’huile ayant le même indice de réfraction que le verre.
 

En principe les lamelles ont 17 µm d'épaisseur, soit 17 mm pour les 100 lamelles de la boîte. Si la valeur mesurée est différente, il suffit de tourner la bague portée par l'objectif.

Indispensable à connaître en photographie classique (180 mm pour un télé, 28 mm pour un grand-angle), la distance focale des objectifs pour microscope n’est généralement pas indiquée sur l’objectif  ; elle est comprise entre 16 et 3 mm pour les objectifs à sec et entre 3 et 1,5 mm pour les objectifs à immersion. L’objectif pour microscope est donc un super grand-angulaire de distance focale extrêmement petite, mais on le définit surtout par son ouverture numérique.
 

Le pouvoir pénétrant ou profondeur de foyer désigne l’épaisseur de la zone dans laquelle tous les points de l’objet sont vus avec netteté ; il est l’équivalent de ce que l’on appelle profondeur de champ en photographie. Les éléments situés avant ou après cette tranche ne sont plus perçus avec autant de précision.

Le pouvoir pénétrant diminue lorsqu’on augmente l’ouverture numérique de l’objectif. Aux forts grandissements la zone de netteté est très faible et il est nécessaire de passer par les différents ‘étages’ de la préparation pour avoir une bonne idée de la façon dont l’objet est organisé dans l’espace.

Pour augmenter le pouvoir pénétrant il faut fermer légèrement le diaphragme d’ouverture placé dans le condenseur ; la netteté semble augmenter mais l’ouverture numérique du condenseur diminue (elle devient inférieure à l’ouverture numérique de l’objectif) et le pouvoir séparateur est diminué.

Remarque : En général on n’utilise jamais le diaphragme d’ouverture à la valeur de l’ouverture numérique de l’objectif, on le ferme toujours un peu pour avoir une plus grande profondeur de champ et un peu plus de contraste (on le ferme bien souvent aux trois quarts ou aux deux tiers de l’ouverture numérique de l’objectif).
 

C’est la capacité pour un objectif de rendre visible deux points situés côte à côte.

Il peut être calculé à partir de l’équation de Abbe
PS = Pouvoir Séparateur = 0,61 λ / 2 x ON = λ / 2n sin α
PS = plus petite distance entre deux points rapprochés nettement visibles séparément.
λ = la longueur d’onde de la lumière (de 400 à 760 nm pour la lumière blanche)
ON = Ouverture numérique (= NA = Numerical Aperture).
n = indice de réfraction du milieu dans lequel travaille l’objectif.
α = angle formé par l’axe de l’objectif et les rayons extrêmes le traversant et participant à la formation de l’image.

Pour avoir la plus petite valeur possible de PS il y a donc trois solutions :

- diminuer λ [ex. en utilisant une lumière violette (400 nm) ou ultraviolette(330 nm)
- augmenter n [utiliser l’huile à immersion].
- augmenter α [en travaillant avec un objectif qui s’approche davantage de l’objet (objectif à immersion)].

Remarque 1 : Pour un apochromatique 100x l’ON ne dépasse pas 1,40 et la lumière visible a une λ variant de 400 à 760 nm ; le PS est donc obligatoirement limité.

Remarque 2 : Ce PS n’augmente pas lorsque l’on utilise un oculaire plus puissant ; l’image est plus grande mais on ne voit pas plus de détails.

Remarque 3 : Pratiquement on peut admettre que le grossissement total d’un microscope est au maximum de 1000 fois l’ON de son objectif. Ex. : un objectif 100x d’ouverture numérique 1,25 donnera une image 1250 fois plus grande que l’objet. Il est inutile d’utiliser un oculaire supérieur à 12,5x.
 

C’est la distance qui sépare la zone d’insertion de l’objectif à la tourelle et le plan de la préparation. Autrefois cette distance était de 37 mm mais la construction d’objectifs complexes, à nombreuses lentilles, a entraîné une nouvelle norme et cette distance a été allongée à 45 mm. Pour utiliser les anciens objectifs parafocalisés à 36 mm sur les nouveaux microscopes parafocalisés à 45 mm il faut utiliser une bague d’adaptation de 9 mm.

Distance parafocale et Distance frontale

Distance entre la lamelle et la lentille frontale de l’objectif. Plus l’objectif a un grandissement important, plus cette distance diminue (1/10 de mm pour un 100x immersion). Il faut donc prendre des précautions pour ne pas abîmer l’objectif (ni la préparation) lors de la mise au point. Les objectifs modernes ayant un grandissement supérieur à 40x sont équipés d’un dispositif anti-choc, ils disposent d’un système à ressort qui évite la détérioration de la lentille frontale (et de la préparation).

- Les objectifs achromatiques sont ceux que l’on utilise le plus communément en mycologie. Ils sont corrigés achromatiquement pour deux longueurs d’onde, le bleu et le rouge et l’aberration de sphéricité est corrigée pour une longueur d’onde, généralement le jaune-vert.

- Les objectifs semi-apochromatiques ou objectifs à la fluorine sont corrigés pour deux (ou trois) longueurs d’onde pour les aberrations de chromatisme et pour les aberrations de sphéricité. Cette correction plus poussée est possible grâce à l’emploi de fluorine naturelle ou depuis peu de fluorine de synthèse ; elle permet également d’atteindre des ouvertures numériques plus importantes.

Correction des aberrations chromatiques

- Les objectifs apochromatiques utilisent de la fluorine, des verres spéciaux, un plus grand nombre de lentilles et des traitements multicouches des surfaces ; ils sont corrigés pour 3 ou quatre longueurs d’onde et leur aberration de sphéricité est corrigée pour le bleu et le rouge. Ce sont les objectifs qui ont les meilleures ouvertures numériques et qui permettent de distinguer les plus petits détails lors de l’examen des préparations (seul inconvénient : leur prix qui les met hors de portée des amateurs).

Avec les trois catégories d’objectifs précédemment citées, la courbure de champ n’est pas éliminée. Lorsqu’on fait la mise au point au centre, les bords de l’image sont flous et lorsqu’on fait la mise au point sur une zone périphérique, le centre n’est plus net. Pour éviter ce phénomène, il est possible de rendre ces objectifs plans. Ils donnent des images planes et nettes du centre à la périphérie. Ils existent pour chacune des catégories d’objectifs précédents, les plus performants étant les objectifs planapochromatiques. Etant donné leur prix exorbitant on les trouve surtout dans les catalogues et la grande majorité des mycologues utilise des objectifs achromatiques ou planachromatiques s’ils désirent des photomicrographies de meilleure qualité.

3 exemples d'objectifs            achromatiques (1) objectif Achromatique simple (2) Objectif Achromatique Plan (3) Objectif Achromatique                      Super Plan           (à très grand champ optique)

Les objectifs qui travaillent dans l’air (objectifs à sec) ont une ON limitée à 0,95. Pour augmenter cette valeur et avoir un meilleur pouvoir séparateur on met de l’huile entre la lentille frontale de l’objectif et la lamelle. Cette huile a un indice de réfraction proche de celui du verre (n = 1,515), ce qui évite plusieurs déviations des rayons lumineux. Les objectifs fonctionnant de cette façon sont appelés les objectifs à immersion et sur leur monture on trouve l’un des termes suivants : ‘Oil’, ‘oel’ ou ‘HI’ (homogeneous immersion). Ces objectifs permettent de déceler les plus fins détails d’une préparation avec une ON atteignant 1,40 pour les objectifs apochromatiques.

Remarque 1 : Pour utiliser pleinement l’ouverture numérique de 1,25 - 1,40 des objectifs apochromatiques, une goutte d’huile doit également être déposée entre la lentille supérieure du condenseur et la lame (sinon on n’atteint même pas l’ouverture 1). Ce dépôt d’huile entre le condenseur et la lame est toutefois inutile dans le cas d’un objectif achromatique qui nécessite toujours une légère fermeture de son diaphragme d’ouverture.

Schéma du dispositif d'observation en immersion homogène avec un objectif planapochromatique de grande ouverture numérique (n= 1,40) : l'huile est nécessaire sur la lamelle mais également entre la lame et le condenseur ; les rayons lumineux ne passent pas dans l'air (n= 1), ils se propagent dans un milieu ayant pratiquement toujours le même indice de réfraction que le verre. Dans la grande majorité des cas, l'huile est simplement placée entre la lamelle et l'objectif.
 

Sur certains objectifs à immersion on trouve le sigle W ou le sigle Gly. Ces objectifs ont été calculés pour une immersion dans l’eau ou dans la glycérine (ne pas les utiliser avec de l’huile à immersion classique).

Remarque 2 :

- Autrefois on utilisait la résine de cèdre ou huile de cèdre (n = 1,52) mais lorsque celle-ci n’était pas essuyée correctement en fin de séance, elle durcissait et, lors du nettoyage, il y avait risque de détérioration de l’objectif à immersion qui est très onéreux.

- Actuellement on utilise des huiles de synthèse non résinifiables, à indice de réfraction n = 1,518. Ces huiles ne durcissent pas et il n’est pas nécessaire de nettoyer avec minutie l’objectif après chaque utilisation du microscope ; il suffit d’essuyer l’objectif avec le doigt. Ces huiles de synthèse sont disponibles en différentes viscosités ; pour les utilisations de platines microscopiques en position verticale elles sont très visqueuses, pour les utilisations en ambiance froide, elles sont très fluides. En mycologie on utilise uniquement l’huile de viscosité normale.