1. les produits pour les réactions
colorées thallines

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2. les réactifs pour l'étude des
structures microscopiques

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3. les réactifs pour les
microcristallisations

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4. les produits pour la
chromatographie

2ème partie - Les produits pour les observations microscopiques

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Asque multisporé de

Candelaria concolor

Montage dans le Rouge Congo

ammoniacal (C. Van Haluwyn)

Paraphyses, asque et spore de

Teloschistes chrysophtalmus

Coloration au Rouge Congo

Les colorants rouges

a) Le Rouge Congo est largement utilisé en microscopie lichéno-mycologique comme colorant universel. Il colore en rose ± rougeâtre les parois des hyphes fongiques. Utilisable surtout sur matériel frais et exsiccata, ce colorant montre bien les hyphes, les cloisons, les boucles et plus particulièrement la forme et la disposition des paraphyses.

Le rouge Congo ammoniacal

On l'utilise obligatoirement quand on opère sur du matériel sec (échantillons d'herbier). L'ammoniaque permet le ramollissement et le regonflement des structures aussitôt colorées par le Rouge Congo. Souvent la coloration est trop vive et il est préférable, après coloration, de faire le montage dans de l'eau ou mieux dans de l'eau glycérinée qui s'évapore moins rapidement. Les structures colorées se détachent mieux du fond qui n'est plus rose rougeâtre mais transparent.

Composition du rouge Congo  ammoniacal

Rouge Congo ...................... 1 g

Ammoniaque ..................... 99 mL à 30%

Préparation : Sous une hotte aspirante, dans un erlenmeyer à col étroit, mettre 1 g de rouge congo. Introduire rapidement 99 mL de la solution commerciale d’ammoniaque (à 30% généralement) et placer aussitôt un verre de montre sur l’erlenmeyer pour limiter l’évaporation de l’ammoniac qui est un gaz extrêmement irritant. Agiter avec l’agitateur magnétique et, éventuellement, chauffer pour faciliter la dissolution du colorant (sans excès car l’ammoniaque passe à l’état de gaz à partir de 35°C). Laisser refroidir puis filtrer en plaçant un couvercle sur l’entonnoir (d'après Erb et Matheis - Pilz Mikroskopie - 1983).

Remarque 1 : Ne pas passer son nez au-dessus du flacon !

Remarque 2 : Ne laisser pas le flacon ouvert inutilement ! Cela évite l’odeur désagréable mais empêche aussi le contact avec le CO2 atmosphérique qui forme avec l’ammoniaque du carbonate d’ammonium responsable de la cristallisation du colorant ; la solution devient progressivement inefficace. Il est possible de prolonger son action en ajoutant un peu d’ammoniaque dans le flacon mais lorsque la concentration devient insuffisante, le Rouge Congo forme des dépôts et devient inutilisable au bout de 2 à 3 années.

Le rouge Congo aqueux

Sur matériel frais on utilise la solution aqueuse ; il est parfois nécessaire de faire un prétraitement à la potasse (KOH à 3% ou même 10% en fonction de la cohésion des hyphes) sans oublier de laver avant traitement au Congo aqueux.

Composition du rouge Congo aqueux (seulement 0,5 % d’ammoniaque)

Rouge Congo ........................................... 3 g
Eau bidistillée ........................................  98 mL
Ammoniaque ..........................................  2 mL à 25%

Préparation : Sous la hotte aspirante reliée à l'extérieur, dissoudre les 3 g de Rouge Congo dans 98 mL d'eau bidistillée, ajouter ensuite 2 mL d’ammoniaque (d'après Erb et Matheis - Pilz Mikroskopie - 1983) afin de faciliter l’action du colorant.

Le rouge Congo SDS (Sodium Dodécyl Sulfate)

Une autre composition a été imaginée par M. Monod, qui ne met pas d’ammoniaque mais ajoute 1g de Sodium Dodécyl Sulfate (SDS), un agent tensio-actif anionique qui rend la solution plus mouillante. Le SDS ne doit toutefois pas être utilisé en présence de KOH (formation de précipités).

Composition du rouge Congo SDS (Sodium Dodécyl Sulfate)

Rouge Congo ................................................. 1 g
Eau bidistillée ..............................................  99 mL
SDS .............................................................  1 g

Spore de Pertusaria leioplaca - montage dans le Rouge Congo SDS

Monatge dans le mélange

RC + Phloxine B

b) La phloxine B : est un colorant synthétique, fabriqué à partir d’hydrocarbures issus du goudron de houille. En solution aqueuse à 2%, la phloxine B colore en rouge le cytoplasme des cellules mortes, sans colorer les parois des hyphes et les cloisons.  

La phloxine B peut être utilisée en mélange avec d’autres colorants. En association avec le rouge Congo elle permet la double coloration. Déposer sur une lame une petite goutte de Congo puis à proximité une petite goutte de phloxine ; mélanger avec une épingle et y placer la coupe à colorer. Mettre une lamelle et dissocier par tapotements successifs. Il y a ainsi coloration des parois des hyphes par le Congo et du contenu des cellules par la phloxine. L’introduction de potasse à 5% permet, si nécessaire, d’éclaircir la préparation pour faciliter les observations (il n’est toutefois pas possible de prolonger l’observation très longtemps car la phloxine devient rapidement noirâtre en présence de KOH). 

Composition de la Phloxine B

Phloxine B..................................................... 2 g
Eau bidistillée .............................................  100 mL
SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) ....................  1 g

Préparation : dissoudre en agitant 2 g de phloxine B dans 100 mL d’eau bidistillée ; ajouter 1g de Sodium Dodécyl Sulfate (SDS), un agent tensioactif anionique qui facilite la pénétration de la phloxine dans le cytoplasme. Le SDS ne doit toutefois pas être utilisé en présence de KOH (formation de précipités).

Asque octosporé et spores murales - montage dans la phoxine B

c) Le soudan III permet de colorer les inclusions lipidiques (guttules) trouvées fréquemment dans les ascospores. Le soudan III est soluble dans des solvants de type white spirite mais n’est pas facilement miscible à l’eau ; son utilisation en mycologie/lichénologie pose donc des problèmes, l’eau étant le principal constituant des êtres vivants.

On peut utiliser le soudan III en solution alcoolique saturée mais l’éthanol provoque un rétrécissement important des structures cellulaires.

Préparation selon Erb et Mattheis : Faire une solution saturée de soudan III dans un mélange à part égales d’eau et de chloral hydraté. Pour atteindre la concentration nécessaire de 0,1 à 0,2% de soudan III, il faut placer le flacon contenant le mélange pendant au moins 2 jours sur l’agitateur magnétique (la dissolution est très lente) ; faire ensuite une filtration.

Composition et préparation du Soudan III dans le lactophénol (selon M. Langeron)

- Préparer le lactophénol dans un ballon avec l’agitateur magnétique.

Eau bidistillée ...................  20 mL
Glycérine .......................... 40 g (33,3 mL)
Acide lactique ...................  20 g (16,6 mL)
Phénol .............................  20 g

- Quand l’ensemble est homogène et transparent, ajouter le colorant en excès.

Soudan III .........................  1 g

- Couvrir l’erlenmeyer d’un verre de montre.
- Agiter jusqu’à intégration du colorant au lactophénol.
- Porter à ébullition douce quelques minutes.
- Laisser refroidir et filtrer.

Un colorant vital est une substance qui met en évidence une structure cellulaire sans provoquer la mort immédiate de la cellule. Pour cela il faut que le colorant soit utilisé à concentration extrêmement faible et qu'un élément cellulaire soit capable de l'accumuler.

d) le rouge neutre qui permet de mettre en évidence les vacuoles cytoplasmiques.

Le rouge neutre à faible concentration ne tue pas les cellules, c'est un colorant vital.

En solution à 1‰ le rouge neutre entre dans les vacuoles dont les membranes vivantes ne sont perméables que dans un seul sens, le rouge neutre ne peut pas sortir, son accumulation permet de mettre en évidence les vacuoles.